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吸光光度分析法

[日期:2011-06-24] 来源:  作者: [字体: ]
 基于物质对光选择性吸收而建立起来的分析方法,称为吸光光度分析法。本章重点讨论可见光区的吸光光度分析。

第一节吸光光度分析概述

  吸光光度分析法(absorption spectrophotometry),包括比色分析法、可见分光光度法、紫外分光光度法和红外分光光度法等。与经典的化学分析方法相比,吸光光度法具有以下几个特点:

1.灵敏度高吸光光度法主要用于测定试样中微量或痕量组分的含量。测定物质浓度下限一般可达10—5~10—6 mol·L—1,若被测组分预先加以富集,灵敏度还可以提高。

2.准确度高比色法测定的相对误差为5%~10%,分光光度法测定的相对误差为2%~5%,完全可以满足微量组分测定的准确度要求。若采用精密分光光度计测量,相对误差可减小至1%~2%。

3.仪器简便,测定速度快吸光光度法虽然需要用到专门仪器,但与其它仪器分析法相比,比色分析法和分光光度法的仪器设备结构均不复杂,操作简便。近年来由于新的高灵敏度、高选择性的显色剂和掩蔽剂的不断出现,常常可以不经分离而直接进行比色或分光光度测定,使测定显得更为方便和快捷。

4.应用广泛吸光光度法能测定许多无机离子和有机化合物,既可测定微量组分的含量,也可用于一些物质的反应机理及化学平衡研究,如测定配合物的组成和配合物的平衡常数,弱酸、弱碱的离解常数等。

第二节吸光光度分析的基本原理

一、溶液的颜色和对光的选择性吸收

1.光的基本性质

  光是一种电磁波。电磁波范围很大,波长从10—1 nm~103 m,可依次分为X–射线、紫外光区、可见光区、红外光区、微波及无线电波,见表8—1。

表8-1电 磁 波 谱

区域

λ/ nm

X – 射 线

10-1~10

远紫外光区

10~200

近紫外光区

200~400

可 见 光 区

400~760

近红外光区

760~5×104

远红外光区

5×104~1×106

微波

1×106~1×109

无 线 电 波

1×109~1×1012

注:1 m = 109 nm

  人的眼睛能感觉到的光称为可见光(visible light)。在可见光区内,不同波长的光具有不同的颜色,只具有一种波长的光称为单色光,由不同波长组成的光称为复合光。日常我们所看到的太阳光、白炽灯光、日光灯光等白光都是复合光,它是由400~760 nm波长范围内的红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色的光按一定比例混合而成的。

  实验证明,如果将两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合,也可以得到白光,我们通常将这两种颜色的单色光称为互补色光。图(8—1)为互补色光示意图,图中处于直线关系的两种颜色的光是互补色光,它们彼此按一定比例混合即成为白光。

2.溶液的颜色和对光的选择性吸收

  物质呈现的颜色与光有密切的关系,当光照射到物质上时,由于物质对于不同波长的光的反射、散射、折射、吸收、透射的程度不同,使物质呈现不同的颜色。

  对于溶液来说,它所呈现的不同颜色,是由于溶液中的质点选择性地吸收了某种颜色的光而引起的。当一束白光通过某溶液时,如果溶液对各种颜色的光均不吸收,入射光全透过,或虽有吸收,但各种颜色的光透过程度相同,则溶液是无色的;如果溶液只吸收了白光中一部分波长的光,而其余的光都透过溶液,则溶液呈现出透过光的颜色,在透过光中,除吸收光的互补色光外,其它的光都互补为白光,所以溶液呈现的恰是吸收光的互补色光的颜色。例如,CuSO4溶液选择性地吸收了白光中的黄色光而呈现蓝色;KMnO4溶液选择性地吸收了白光中的绿色光而呈现紫红色。表8—2列出了溶液颜色与吸收光颜色和波长的关系,可以作为测定时选择入射光波长范围的参考。

表8-2溶液颜色与吸收光颜色和波长的关系

溶液颜色

吸收光

颜色

λ/ nm

黄绿

400 ~ 450

450 ~ 480

绿蓝

480 ~ 490

蓝绿

490 ~ 500

紫红

绿

500 ~ 560

黄绿

560 ~ 580

580 ~ 600

绿蓝

600 ~ 650

蓝绿

650 ~ 760

3.吸收光谱

  物质对光的吸收具有选择性,如果要知道某溶液对不同波长单色光的吸收程度,我们使各种波长的单色光依次通过一定浓度的某溶液,测量该溶液对各种单色光的吸收程度,并记录每一波长处的吸光度,然后以波长为横坐标,吸光度为纵坐标作图,得一曲线,即该物质的光吸收曲线或吸收光谱(absorption spectrum)。对应于光吸收程度最大处的波长称最大吸收波长(maximum absorption),以λ最大或λmax表示,如图(8-2)所示。在λmax处测定吸光度灵敏度最高,故吸收光谱是吸光光度法中选择入射光波长的重要依据。

图8-2吸收光谱示意图

  吸收光谱可以清楚、直观地反映出物质对不同波长光的吸收情况。图(8-3)是四种不同浓度的KMnO4溶液的吸收光谱。由图可知:①在可见光范围内,KMnO4溶液对不同波长的光的吸收情况不同,对波长为525 nm的绿色光吸收最多,有一吸收高峰;②四条曲线的最大值均出现在525 nm波长处,即KMnO4溶液的最大吸收波长λmax = 525 nm,不随浓度的变化而改变,且不同浓度KMnO4溶液的吸收光谱形状是完全相似的。不同物质的吸收光谱形状和最大吸收波长均不相同,各种物质均有它的特征吸收光谱,以此可作为定性分析的依据;③不同浓度的同种物质溶液,在一定波长处吸光度随溶液浓度的增加而增大。以此可作为定量分析的依据。

图8-3KMnO4水溶液的吸收光谱

二、光吸收定律—朗伯-比耳定律

  朗伯-比耳定律(The Lambert-Beer’s Law)是光吸收的基本定律,是吸光光度法进行定量分析的理论基础。

1.朗伯-比耳定律

  当一束平行的、强度为I0的单色光垂直照射于厚度为b、浓度为c的单位截面积的均匀液层时,如图(8—4),由于溶液中吸光质点对入射光部分吸收,使透过光强度降至It。如果将液层分成厚度为无限小的

图8—4 光吸收示意图

  相等薄层,每一薄层厚度为db,又设薄层内含有dn个吸光质点,照射到薄层上的光强度为I,光通过薄层后,强度变化量为dI,则dI与I成正比,也与dn成正比,即:

(8-1)

(8-2)

(8-1)式中负号表示光强度因吸收而减弱,K1、K2为比例常数。将式(8-2)代入式(8-1),合并常数项,得到:

(8-3)

对(8-3)式进行积分:

(8-4)

式(8-4)就是朗伯—比耳定律的数学表达式。式中的表示溶液对光的吸收程度,称为吸光度(absorbance),用A表示;b为液层厚度,单位是cm;k为比例常数,它与入射光的波长、有色物质的性质和溶液的温度等有关。当溶液浓度c的单位为g·L—1时,比例常数k以表示,称为吸光系数(absorption coefficient),单位为L·g—1·cm—1,这时式(8-4)为:

(8-5)

  当溶液浓度c的单位为mol·L—1时,比例常数k以表示,称为摩尔吸光系数(molar absorptivity),单位为L·mol—1·cm—1,这时式(8-4)为:

(8-6)

  朗伯-比耳定律的意义是:当一束平行单色光通过均匀的、非散射性的溶液时,溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度成正比。此定律不仅适用于可见光,也适用于红外光和紫外光;不仅适用于均匀的、非散射性的溶液,也适用于气体和均质固体,但辐射与物质之间应只有吸收而没有荧光和光化学现象。

  此外,在含有多种吸光物质的溶液中,只要各种组分之间相互不发生化学反应,朗伯-比耳定律适用于溶液中每一种吸收物质。故当某一波长的单色光通过这样一种多组分溶液时,由于各种吸光物质对光均有吸收作用,溶液的总吸光度应等于各吸收物质的吸光度之和,即吸光度具有加和性。设体系中有n个组分,则在任一波长处的总吸光度可以表示为:

(8-7)

  在吸光光度分析中,也常用透光率(transmittance)来表示光的吸收程度。透过光强度It与入射光强度I0之比,称为透光率或透射比,用T表示,即

(8-8)

很显然,吸光度与透光率的关系为:

(8-9)

(8-10)

例8—1有一浓度为1.6′10—5 mol·L—1的有色溶液,在430 nm处的摩尔吸光系数为3.3′104 L·mol—1·cm—1,液层厚度为1.0 cm,计算其吸光度和透光率。

解:

2.摩尔吸光系数

  摩尔吸光系数的物理意义是:当溶液的浓度为1 mol·L—1,液层厚度为1 cm时溶液对特定波长光的吸收能力。值在数值上虽等于浓度为1 mol·L—1,液层厚度为1 cm时溶液的吸光度,但是,在实际分析中,一般不能直接取1 mol·L—1这样高浓度的溶液来测定,而是测定适当低浓度吸光物质溶液的吸光度,然后计算出值。

例8-2用邻二氮菲光度法测定铁。已知Fe2+浓度为1 000 μg·L—1,液层厚度为2.0 cm,在波长510 nm处测得吸光度为0.38,计算摩尔吸光系数。

  由于摩尔吸光系数值与吸收波长有关,也与仪器的测量精度有关,在书写时应标明波长。例如,上述邻二氮菲铁的值,应表示为510 = 1.1′104 L·mol—1·cm—1。

  摩尔吸光系数反映吸光物质对某一波长光的吸收能力,也反映了用吸光光度法测定该吸光物质的灵敏度,值的大小决定于入射光的波长和吸光物质的吸光特性,也受溶剂和温度的影响,而与吸收物质的浓度和吸收光程无关。不同的吸光物质具有不同的值;同一吸光物质对不同波长的光具有不同的值。有色化合物的摩尔吸光系数是衡量显色反应灵敏度的重要指标。一般<2′104,灵敏度较低;在2′104~6′104之间属中等灵敏度;在6′104~1′105之间属高灵敏度;>105属超高灵敏度。

第三节显色反应及其条件的选择

一、显色反应

  比色分析法及可见吸光光度法是利用有色溶液对光的选择性吸收来进行测定的。有些物质本身有明显的颜色,可用于直接测定,但大多数物质本身颜色很浅甚至是无色,这时就需要加入某种试剂,使原来颜色很浅或无色的被测物质转化为有色物质再进行测定。这种将被测组分转变成有色化合物的反应称为显色反应(colour reaction),所加入的试剂称作显色剂(chromogenic reagent)。在吸光光度分析中所用到的显色反应主要有配位反应、氧化还原反应等。

  用于吸光光度分析的显色反应应满足下列要求:

(1)选择性好,干扰少最好只有被测组分发生显色反应,如果其它干扰组分也显色,则要求被测组分所生成有色化合物与干扰组分所生成有色化合物的最大吸收峰相距较远,彼此互不干扰。

(2)灵敏度高因为吸光光度法一般是测定微量组分,故应选择能生成摩尔吸光系数大的有色化合物的显色反应,这样测定灵敏度高,有利于微量组分的测定。灵敏度高的显色反应,有色物质的值可达104~105 L·mol—1·cm—1。但要注意,灵敏度高的反应,选择性不一定好,所以,二者应该兼顾。

(3)有色化合物的组成恒定显色反应应按确定的反应式进行,对于形成多种配位比的配位反应,应控制条件,使其组成固定,这样被测物质与有色化合物之间才有定量关系。

(4)有色化合物的性质稳定对于空气中的氧、二氧化碳、灰尘等不敏感,不容易受溶液中其它化学因素的影响,以保证吸光度测定的重现性。

(5)色差大有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大,显色剂在测定波长处无吸收。通常把两种吸光物质最大吸收波长之差的绝对值称为对比度,用Δλ表示,要求有色化合物与显色剂的Δλ>60 nm。

二、显色反应条件的选择

1.显色剂用量

  显色反应在一定程度上是可逆的,一般可用下式表示:

  为了使反应进行完全,应加入过量的显色剂,但是显色剂加得太多,有时会引起副反应,对测定不利。显色剂的适宜用量可通过实验来确定,其方法是:将被测试液的浓度及其它条件固定,加入不同量的显色剂,在相同条件下测定吸光度,并以吸光度为纵坐标,显色剂用量(或浓度)为横坐标,绘制吸光度-显色剂用量关系曲线,如图(8—5)所示。

图8—5(1)中曲线表示随着显色剂用量的增加,在某显色剂用量范围内所测得的吸光度达最大且恒定(曲线出现较平坦部分),表明显色剂用量已足够,就可在ab范围内确定显色剂的加入量。

图8-5(2)中曲线出现的平坦部分较窄,当显色剂用量继续增加时,吸光度反而下降,这种情况就要严格控制显色剂用量在a’b’范围内。

(1)(2)

图8—5A-c(R)图

2、溶液的酸度

酸度对显色反应主要有以下几个方面的影响:

(1)影响配合物的组成许多显色剂是有机弱酸阴离子,随着酸度增加,将引起平衡移动,使显色剂浓度下降,配位不完全,且所生成有色化合物的稳定性降低。

对能形成多级配合物的显色反应,不同酸度条件下形成不同配位比的配合物。如Fe3+与磺基水杨酸反应,在pH = 2~3的溶液中,Fe3+与试剂生成1:1的紫红色配合物;pH = 4~7时,生成1:2的橙色配合物;pH = 8~10时,生成1:3的黄色配合物。

(2)影响显色剂的颜色许多显色剂具有酸碱指示剂的性质,在不同的酸度条件下,显色剂本身的颜色不同。例如二甲酚橙,当溶液的pH小于6.3时,它主要以黄色的H3In3—形式存在,pH大于6.3时,它主要以红色的H2In4—形式存在。大多数金属离子与二甲酚橙生成紫红色配合物,因而应控制溶液pH小于6.3时进行测定。

(3)影响被测离子的存在状态多数金属离子因酸度的降低而发生水解,形成各种型体的多羟基配合物,甚至析出沉淀,无法进行光度测定。

显色反应的适宜酸度也必须由条件实验来确定。具体方法是:固定溶液中被测组分与显色剂浓度等条件,改变溶液的pH,分别测定其吸光度,绘制A-pH曲线(如图8—6),从中找出适宜的酸度范围。

图8—6A—pH图

3.显色温度

显色反应一般在室温下进行,但有些显色反应受温度影响很大,室温下进行很慢,必须加热至一定温度才能迅速完成。但有些有色化合物当温度较高时会发生分解。合适的显色温度也要通过实验,绘制吸光度—温度曲线,从中找出适宜的温度范围。

4.显色时间

由于显色反应的速度不尽相同,溶液颜色达到稳定状态所需时间不同。有些显色反应在瞬间即完成,而且颜色在较长时间内保持稳定,但多数显色反应需一定时间才能完成。有些显色反应产物,由于受空气氧化等因素的影响而分解褪色,所以要根据具体情况,掌握适当的显色时间,在颜色稳定的时间内进行测定。

适宜的显色时间和有色溶液的稳定程度,也是通过实验确定的。配制一份显色溶液,从加入显色剂开始计时,每隔一段时间测定一次吸光度,绘制一定温度下的吸光度-时间关系曲线,就可以找出适宜的显色时间和溶液颜色稳定时间。

5.溶剂

  许多有色化合物在水中解离度比较大,而在有机相中解离度小,故加入适量的有机溶剂或用有机溶剂萃取,可以颜色加深,提高显色反应的灵敏度。

三、测定中的干扰及其消除方法

试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定。干扰离子的影响有以下几种情况:

(1)干扰离子本身有颜色如Co2+(红色)、Ni2+(翠绿色)、Cu2+(蓝色)等。

(2)干扰离子与显色剂生成有色化合物如用NH4SCN测定Co2+时,干扰离子Fe3+与SCN—生成血红色配合物,从而引起正误差。

(3)干扰离子与显色剂生成无色化合物例如磺基水杨酸测定Fe3+时,干扰离子Al3+与磺基水杨酸生成无色配合物,消耗了大量显色剂,使被测离子配位不完全,导致负误差。

(4)干扰离子与被测组分生成配合物或沉淀例如用磺基水杨酸测定Fe3+时,若溶液中存在F-和HPO,则F-与Fe3+生成稳定的无色配合物,HPO与Fe3+生成磷酸盐沉淀,使被测离子浓度下降,不能充分显色而引起负误差,甚至可能无法进行测定。

消除共存离子干扰的方法:

(1)加掩蔽剂 使它与干扰离子形成很稳定的无色配合物(或虽有颜色,但与被测有色化合物的颜色有较大差别,不影响测定),而不与被测离子形成配合物或只形成极不稳定的配合物,因而消除了干扰离子的影响。例如在NH4SCN测定Co2+时,加入NaF可消除Fe3+的干扰。

(2)控制酸度 是一种常用的、简便而有效的消除干扰的方法。许多显色剂是有机弱酸或弱碱,并且与不同金属离子生成的配合物稳定性不同,因此控制显色溶液的酸度,就可以控制显色剂各种型体的浓度,从而使某种金属离子显色,而另外一些金属离子不能生成稳定的有色化合物。例如控制pH = 2~3时,用磺基水杨酸测定Fe3+,可消除Cu2+、Al3+的干扰,此法甚至可用于铜合金中微量铁的测定。

(3)利用氧化还原反应改变干扰离子价态许多显色剂对变价元素的不同价态离子的显色能力不同。例如在Fe3+干扰铬天青S测定Al3+时,可加入抗坏血酸使Fe3+还原为Fe2+,干扰即可消除。

(4)选择适当的测定波长 为了使分析测定有较高的灵敏度和准确度,应选择待测物质的最大吸收波长为测定波长,但是当在此波长处存在干扰时,可适当降低灵敏度,选择干扰小的波长为测定波长。

(5)选用适当的参比溶液 在光度分析中,用参比溶液来调节仪器的吸光度零点,可以抵消某些影响分析的因素带来的误差,因此选择适当的参比溶液,在一定程度上可达到消除干扰的目的。

(6)分离若上述方法均不能满足要求时,应采用沉淀、离子交换或溶剂萃取等分离方法消除干扰,其中以萃取分离应用较多。

四、显色剂

1.无机显色剂

无机显色剂与被测离子形成的配合物大多不够稳定,灵敏度比较低,有时选择性还不够理想,而且无机显色剂的目也很有限,因此无机显色剂在吸光光度分析中应用不多。

2.有机显色剂

大多数有机显色剂与金属离子形成稳定的螯合物,显色反应的选择性和灵敏度也都较高。随着有机试剂合成的发展,有机显色剂的应用日益增多,如磺基水杨酸、邻二氮菲、双硫腙、丁二酮肟、铬天青S 、偶氮胂Ⅲ等。均是较为常用的有机显色剂。

第四节吸光光度分析方法及仪器

一、目视比色法

  有色溶液颜色的深浅与浓度有关,溶液愈浓,颜色愈深,直接用眼睛比较溶液颜色的深浅以确定被测组分含量的方法称为目视比色法,最常用的是标准系列法。在一套质料相同、大小形状一样的玻璃比色管内,依次加入不同体积的含有已知浓度被测组分的标准溶液,并分别加入显色剂和其它试剂,稀释至相同体积,摇匀后得到一系列颜色深浅逐渐变化的标准色阶。在另一同样的比色管中加入一定量的被测试液,相同条件下显色。然后从管口垂直向下或从侧面观察,比较被测试液与标准色阶颜色的深浅。若被测试液与某标准溶液颜色深度一样,则表示二者浓度相等;若颜色介于两个相邻标准溶液之间,则被测液的含量也介于二者之间。

  目视比色法所用仪器简单,操作简便,适于大批试样分析,并且是在复合光(白光)下进行测定,某些不符合光吸收定律的显色反应亦可用目视比色法测定。其缺点是:由于许多有色溶液不够稳定,标准系列不能长期保存,常需临时配制标准色阶,比较费时费事。另外,人眼睛的辨色力有限,目视测定往往带有主观误差,使测定的准确度不高。

二、光电比色法

  光电比色法是以光吸收定律为理论基础进行测定的,与目视比色法在原理上并不一样。目视比色法是比较透过光的强度,而光电比色法则是比较有色溶液对某一波长光的吸收程度。由光源发出的复合光,经过滤光片后,用出光狭缝截取光谱中波长很窄的一束近似的单色光,让其通过有色溶液,将透过光转变为电流,所产生的光电流与透过光强度成正比,测量光电流强度,即可知道相应有色溶液的吸光度或透光率,从而确定其浓度。

三、分光光度法

  应用分光光度计测量溶液的吸光度,以确定物质含量的分析方法称为分光光度法。这种方法具有灵敏、准确、快速及选择性好等特点,此外,适用的波长范围也较广,不仅可测定在可见光区有吸收的物质,还可测定在紫外或红外光区有吸收的物质。

  分光光度法的作用原理和测定方法与光电比色法基本相同,获得单色光的方法却不同。光电比色法采用滤光片为色散元件,而分光光度计采用棱镜或光栅等单色器。

利用光电比色计或分光光度计测得吸光度后,可通过下列方法求得待测物的含量。

1.标准曲线法

此为最常用的方法。配制一系列浓度不同的标准溶液,显色后,用相同规格的比色皿,在相同条件下测定各标液的吸光度,以标液浓度为横坐标,吸光度为纵坐标作图,理论上应该得到一条过原点的直线,称为标准曲线。然后取被测试液在相同条件下显色、测定,根据测得的吸光度在标准曲线上查出其相应浓度从而计算出含量,如图(8—7)所示。

图8—7标准曲线

2.比较法

取含有已知准确浓度被测组分的标准溶液,将标准溶液及被测试液在完全相同的条件下显色、测定吸光度,分别以表示标液和试液的吸光度,以c(S)和c(X)表示标液和试液的浓度,根据朗伯-比耳定律可得:         

由于是在同样条件下测同种物质,所以==,则

(8-11)

c (S)已知,可以测得,c (X)便很容易求得。

例8-3准确取含磷30 μg的标液,于25 mL容量瓶中显色定容,在690 nm处测得吸光度为0.410;称取10.0 g含磷试样,在同样条件下显色定容,在同一波长处测得吸光度为0.320。计算试样中磷的含量。

解:因定容体积相同,所以浓度之比等于质量之比,即

采用比较法时应注意,所选择的标液浓度要与被测试液浓度尽量接近,以避免产生大的测定误差。测定的样品数较少,采用比较法较为方便,但准确度不甚理想。

三、仪器

1.光度分析仪器的基本部件

光度分析仪器主要由光源、单色器、吸收池、检测器和显示记录系统五大部件组成。

(1)光源可见光区通常用6~12 V钨丝灯作光源,发出的连续光谱波长在360~1 000 nm范围内。为了获得准确的测定结果,要求光源要稳定,通常要配置稳压器;为了得到平行光,仪器中都装有聚光镜和反射镜等。

(2)单色器入射光为单色光是朗伯-比耳定律的前提条件之一,单色器就是将光源发出的连续光分解为单色光,并可从中分出任一波长单色光的装置,一般由狭缝、色散元件及透镜系统组成。

光电比色计中单色器是滤光片。常用的滤光片是色玻璃制成的,它只允许和它颜色相同的光通过,可得到具有一定波长范围的近似单色光。选择滤光片的原则是:滤光片透过的光应是被测溶液吸收的光,也就是说,滤光片的颜色应与被测溶液的颜色为互补色。

分光光度计中的单色器是棱镜和光栅。棱镜对于不同波长的光具有不同的折射率,因而可以把复合光分解为单色光。光栅是利用光的衍射和干涉作用制成的高分辨率的色散元件,其优点是色散均匀、分辨率高、适用波长范围较宽等。由于分光光度计的单色器能获得纯度较高的单色光,适用的波长范围也较广,所以分光光度法的灵敏度、选择性和准确度等均比光电比色法高。

(3)吸收池吸收池是用于盛装参比液和被测试液的容器,也称比色皿,一般由无色透明、耐腐蚀的光学玻璃制成,也有的用石英玻璃制成(紫外光区必须采用石英池)。厚度有0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 cm等数种规格,同一规格的吸收池间透光率的差应小于0.5%。使用过程中要注意保持比色皿的光洁,特别要保护其透光面不受磨损。

(4)检测器检测器是利用光电效应,将透过的光信号转变为电信号,进行测量的装置。常用的有光电池、光电管、光电倍增管等。

光电池一般在光电比色计及72型分光光度计上采用,硒光电池对光敏感范围为300~800 nm,对500~600 nm的光最灵敏。光电池受强光照射或长久连续使用,会出现“疲劳”现象,即光电流逐渐下降,这时应将光电池置于暗处,使之恢复原有的灵敏度,严重时应更换新的硒光电池。

光电管是由一个阳极和一个光敏阴极构成的真空或充有少量惰性气体的二极管,阴极表面镀有碱金属或碱土金属氧化物等光敏材料,当被光照射时,阴极表面发射电子,电子流向阳极而产生电流,电流大小与光强度成正比。光电管的特点是灵敏度高,不易疲劳。

光电倍增管是在普通光电管中引入具有二次电子发射特性的倍增电极组合而成,比普通光电管灵敏度高200多倍,是目前高中档分光光度计中常用的一种检测器。

(5)显示记录系统显示记录系统的作用是把电信号以吸光度或透光率的方式显示或记录下来。光电流的大小通常用检流计测量,吸光度或透光率可以从表头标尺上读取或采用数字显示。在检流计标尺上,有吸光度和透光率两种刻度,透光率是等刻度的,吸光度刻度是不均匀的,如图(8—8)所示。

图8—8检流计标尺示意图

由于溶液的吸光度与其浓度成正比,所以测定时一般都读取吸光度。

2.分光光度计简介

分光光度计种类很多,一般按工作波长范围分类,紫外、可见分光光度计主要用于无机物和有机物含量的测定,红外分光光度计主要用于结构分析。分光光度计又可根据光学系统的不同,分为单光束分光光度计和双光束分光光度计;根据分光光度计在测量过程中同时提供的波长数,可分为单波长分光光度计和双波长分光光度计等,近年来又出现了电子计算机控制的分光光度计。

(1)单光束分光光度计采用一个单色器,获得可以任意调节的一束单色光,通过改变参比池和样品池位置,使其进入光路,进行参比溶液和样品溶液的交替测量。这种仪器通常由于光源强度的波动和检测系统的不稳定性而引起测量误差,因此,为使仪器工作稳定,必须配备一个很好的稳压电源。国内普遍应用的721型分光光度计就是属于这种类型的仪器,其工作波段为360~800 nm,采用钨灯作光源,棱镜作色散元件,光电管作检测器。经改进的722型分光光度计,采用光栅作色散元件,数字显示,工作波段为320~800 nm,其光学系统如图(8—9)所示。

图8—9722型分光光度计光学系统示意图

单光束可见分光光度计结构简单,操作简便,价格低廉,是一种常规定量分析仪器。

(2)双光束紫外-可见分光光度计双光束分光光度计是将单色器色散后的单色光分成两束,一束通过参比池,一束通过样品池,一次测量即可得到样品溶液的吸光度。国产730型、WFD—10型等分光光度计都属于此类仪器。图(8—10)为WFD—10型双光束紫外-可见分光光度计光学系统示意图。

图8—10WFD—10型分光光度计光学系统示意图

双光束分光光度计是近年来发展最快的一类分光光度计,其特点是便于进行自动记录,可在较短的时间内获得全波段扫描吸收光谱,从而简化了操作手续。由于样品和参比信号进行反复比较,消除了光源不稳定、光学和电子学元件对两条光路的影响。其缺点是由于仪器的光路设计要求严格,价格较高。

(4)双波长分光光度计双波长分光光度计是用两种不同波长的单色光交替照射被测试液,测得被测试液在两种波长条件下的吸光度之差,只要波长选择合适,就扣除了背景吸收等因素的影响。图(8—11)是双波长分光光度计的方框示意图。

图8—11双波长分光光度计示意图

第五节光度分析误差及测量条件的选择

一、光度分析误差

吸光光度法的误差主要来自两个方面:一是偏离朗伯-比耳定律;二是光度测量误差。

1.偏离朗伯-比耳定律

根据朗伯-比耳定律,吸光度与吸光物质的浓度成正比,绘制的标准曲线(或工作曲线)应是一条通过原点的直线。但是在实际工作中,尤其当吸光物质的浓度比较高时,直线常发生弯曲,此现象称为偏离朗伯-比耳定律,如图(8—12)所示,如果在弯曲部分测定,会引起较大的误差。

图8—12偏离朗伯—比耳定律

偏离朗伯—比耳定律的主要原因如下:

(1)非单色光引起的偏离严格地说,朗伯-比耳定律只适用于单色光,但是,即使是现代高精度光度分

析仪器所提供的入射光也不是纯的单色光,而是波长范围较窄的谱带,实质上都是复合光。当入射光为复合光时,由于吸光物质对不同波长光的吸收能力不同,导致标准曲线发生弯曲、偏离朗伯-比耳定律。

在实际工作中,通常选择吸光物质最大吸收波长的光为入射光,这不仅能提高光度分析的灵敏度,而且因为此处的吸收曲线较平坦,值相差不大,即吸光度随波长变化不大,故偏离朗伯-比耳定律的程度较小。

(2)化学、物理因素引起的偏离①朗伯-比耳定律只适用于稀溶液,因此时分子和离子是相互独立的吸光质点。而在高浓度时,溶液中粒子间距离小,彼此相互影响,改变了光吸收能力,引起偏离。②介质不均匀引起的偏离。朗伯-比耳定律要求被测试液是均匀的,当被测试液是胶体溶液、乳浊液或是悬浊液时,入射光一部分被试液吸收,另一部分因反射、散射而损失,使透光率减小而吸光度增加,导致偏离。③溶液中吸光物质因离解、缔合、形成新化合物等化学变化而改变吸光物质的浓度和吸光特性,导致偏离。

2.光度测量误差

  任何分光光度计都有一定的测量误差,它可能来源于光源不稳定、机械振动、光电池(或光电管)不灵敏、读数不准确等因素。但对于给定的仪器来说,读数误差是决定测定结果准确度的主要因素。

  分光光度计的透光率标尺刻度是均匀的,对于同一台分光光度计来说,透光率读数误差ΔT是一个常数,但由于透光率与吸光度是负对数关系,吸光度的刻度不均匀,同样的ΔT在不同吸光度处引起的吸光度误差是不同的。又由于吸光度与被测物质浓度成正比,故相同的ΔT在不同吸光度处所造成的浓度误差是不相同的。当被测物质浓度c很小时,A很小,由相同的ΔT所引起的绝对误差Δc虽不大,但相对误差Δc / c却比较大;当被测物质浓度c很大时,A很大,由相同的ΔT所引起的绝对误差Δc也大,相对误差Δc / c也比较大;只有当被测物质浓度在适当范围内,也就是相应的吸光度在一定范围内时,光度测量所引起读数的相对误差才比较小。通过计算可知,一般被测溶液的吸光度在0.2~0.8或透光率在65%~15%范围内,测量的相对误差较小,能够满足准确度的要求;当A = 0.434(T = 36.8%)时,测量的相对误差最小。

二、测量条件的选择

要  使吸光光度分析有较高的灵敏度和准确度,在选择合适的显色反应条件基础上,还必须注意选择适当的测量条件。

1.选择合适的入射光波长

在实际工作中,入射光波长通常根据被测物质的吸收曲线选择最大吸收波长,因此时吸光物质的摩尔吸光系数的值最大,测定的灵敏度最高,并且,由非单色光引起的对朗伯-比耳定律的偏离小,测定结果准确度高。但如有干扰物质存在,应根据“吸收最大,干扰最小”的原则选择入射光波长,此时测定的灵敏度有所降低,但可以减少干扰。

2.控制适当的读数范围

因为吸光度在0.2~0.8范围内测量的读数误差较小,所以,应尽量使吸光度读数控制在此范围内,为此可采取以下措施:①控制试液的浓度。含量大时,少取样或稀释试液;含量少时,可多取样或萃取富集。②选择不同厚度的比色皿。读数太大时,可改用厚度小的比色皿;读数太小时,改用厚度大的比色皿。

3.选择适当的参比溶液

参比溶液用来调节仪器的零点,即吸光度为零、透光率为100%。以作为测量的相对标准来消除由比色皿、溶剂、试剂、干扰离子等对入射光的吸收、反射、散射等产生的误差。可见光度分析中,一般参照以下方法选择合适的参比溶液。

(1)如果样品溶液、试剂、显色剂均无色时,选溶剂作参比,称为“溶剂空白”;

(2)如果样品溶液有色,而试剂、显色剂无色时,选不加显色剂的样品溶液作参比,称为“样品空白”;

(3)如果试剂、显色剂有色,而样品溶液无色时,选不加样品的试剂、显色剂溶液作参比,称为“试剂空白”。

总之,要求参比溶液能尽量使被测试液的吸光度真实反映待测物质的浓度。

第六节吸光光度分析的应用

一、示差分光光度法

吸光光度法适合于测定微量组分,当用于高含量组分或过低含量组分测定时,会引起较大误差。采用示差分光光度法可以弥补这一缺点。

示差分光光度法是以一个与被测试液浓度接近的标准溶液显色后作为参比溶液进行测量,从而求得被测物含量的分析方法。按所选择的测量条件不同,可以分为高浓度示差分光光度法、低浓度示差分光光度法和使用两个参比溶液的双标准示差分光光度法,它们的测定原理基本相同,其中以高浓度示差分光光度法应用最多。

假设分别以c (s)和c (x)表示参比溶液和被测试液的浓度且c (x)>c (s),根据朗伯-比耳定律可得:

(8-12)

可见,被测试液的吸光度与参比溶液的吸光度之差,与二者浓度差成正比。因此以浓度为c (s)的标液为参比溶液,测定一系列浓度略高于c (s)的标准溶液的吸光度ΔA,将测得的值对Δc值绘制标准曲线。再测定未知试样的吸光度ΔAx,在标准曲线上可查得对应的Δc(x),根据求得c(x),进一步可计算待测组分的含量。

若用一般光度法,以空白参比测得标准溶液的透光率为10%,被测试液的透光率为7%,这样测定吸光度读数误差会很大。若采用示差光度法,以浓度为的标准溶液作参比溶液调零,即将标准溶液的透光率从10%调到100%,此时测定被测试液的透光率将为70%,相当于把仪器的透光率标尺放大了十倍,如图(8—13)所示,使测得的吸光度落在适宜的读数范围内,从而提高了高含量组分光度法测定的准确度。

图8—13示差分光光度法示意图

二、多组分分析

实际工作中所遇到的样品,往往是复杂的多组分体系。当溶液中含有不只一种吸光物质时,由于吸光度的加和性,总吸光度为各组分单独存在时的吸光度之和,因此常有可能在同一试液中不经分离,测定一种以上组分的含量,现以含有两种组分的溶液为例来加以说明。

设某溶液中含有x和y两种组分,其浓度分别为c(x)和c(y),它们的吸收光谱可能会出现如图(8—14)所示的几种情况。

(a)不重叠(b)单向重叠(c)双向重叠

图8—14混合物吸收光谱

如果两种组分的吸收曲线不相互重叠,如图8—14(a)所示,即各组分的最大吸收波长或某些波段处不重叠,x组分最大吸收波长处y组分吸光度为零,y组分最大吸收波长处x组分的吸光度为零,所以两组分互不干扰,就可在各个组分的最大吸收波长条件下,按单组分测定方法分别测定其吸光度,和单组分一样求得分析结果。

图8—14(b)的情况为吸收光谱单向重叠,即x组分对y组分的吸光度有干扰,而y组分对x组分的吸光度不干扰。此时可在λ1和λ2处测混合组分吸光度值,则有:

式中,为x在波长λ1时的摩尔吸光系数;分别为x、y在波长λ2处的摩尔吸光系数。若测定时使用固定比色皿,并用x、y的纯溶液分别测定x、y的摩尔吸光系数,根据测定的值,解联立方程组即可求得x和y两组分的浓度c(x)和c(y)。

图8—14(c)中的情况是吸收光谱双向重叠,两者的吸收曲线在对方的最大吸收峰处都有吸收。测定混合液在λ1和λ2处吸光度可得,并用x、y的纯溶液测得,求解下列联立方程组可得c(x)和c(y)。

对于更多组分体系,可用计算机处理测定结果。

三、双波长分光光度法

用经典的(单波长)分光光度法进行定量分析时,常会遇到下述问题难以解决:多组分吸收曲线重叠,必须解联立方程组才能同时测定,此时计算繁琐且测定具有一定误差;当样品背景吸收(包括比色皿及溶剂的吸收等)较大或为浑浊样品时则不能测定;在经典分光光度法中系使用两个比色皿,比色皿差异所引起的误差不能消除等。为了解决上述问题,可采用双波长分光光度法。

双波长分光光度法系利用双波长分光光度计进行测定。由光源发出的光,分别经过两个单色器,得到两束具有不同波长(λ1和λ2)的单色光,经切光器(斩波器)后,这两光束交替照射于同一试样吸收池,然后测量和记录试液对波长λ1和λ2两光束的吸光度差值ΔA,由此求出待测组分的含量。

对于波长为λ1的单色光,根据朗伯—比耳定律应有:

同理,对于波长为λ2的单色光应有:

式中是溶液在波长为λ1和λ2处的吸光度;是溶液在波长λ1和λ2处的摩尔吸光系数;As为背景吸收或光散射。

将两式相减得:(8-13)

(8-13)式说明,试样溶液对波长为λ1和λ2光束的吸光度差值与待测物质的浓度成正比,这就是应用双波长分光光度法进行定量分析的依据。

四、弱酸和弱碱离解常数的测定

测定弱酸或弱碱的离解常数是分析化学研究工作中常遇到的问题。应用光度法测定弱酸、弱碱的解离常数,是基于弱酸(或弱碱)与其共轭碱(或共轭酸)对光的吸收情况不同。对于一元弱酸有下述解离平衡:

其离解常数为:(8—14)

将式(8-14)两边同取负对数,得:

(8—15)

根据式(8-15)知,为测定pK,需测出pH及ceq(HA)与ceq(A-)的比值。具体方法是:配制分析浓度完全相同而pH不同的三份溶液,第一份溶液的酸性足够强(pH≤pK—2 ),此时,弱酸几乎全部以HA的形式存在,在一定波长下,测定其吸光度:

(8—16)

第二份溶液的在其pK附近,此时溶液中的HA与A-共存,在相同波长下,测定其吸光度:

(8—17)

第三份溶液的碱性足够强(pH≥pK+2),此时,弱酸几乎全部以A-的形式存在,在相同波长下,测定其吸光度:(8—18)

将(8—16)、(8—18)代入(8—17)整理后得:

(8—19)

由式(8—19)可知,只要测出A、AHA、AA-和pH就可以计算出K

五、配合物组成的测定

用分光光度法测定配合物组成的方法很多,这里介绍较简单的摩尔比法和连续变化法。

1.摩尔比法

摩尔比法是利用金属离子同显色剂摩尔比例的变化来测定配合物组成的。在一定条件下配制一系列、固定金属离子M的浓度,显色剂R的浓度依次递增(或者相反)的溶液,,在相同测量条件下分别测定吸光度,以吸光度Ac (R) / c(M)作图,如图(8—15)所示。当c(R)较小时,金属离子没有完全配位,随着c(R)的增大,吸光度不断增高;当c(R)增加到一定程度时,金属离子配位完全,再增大c(R)时,吸光度不再升高,曲线变得平坦,转折处所对应的摩尔比即是配合物的组成。若转折点不明显,则用外推法作出两条直线的交点,交点对应的比值即是配合物的配位比。

图8—15摩尔比法

2.等摩尔连续变化法

等摩尔连续变化法是在实验中连续改变显色剂和金属离子的浓度,使溶液中金属离子和显色剂的物质的量按比例变化,但两者的总量保持一定,即c(M) + c(R) = c(定值)。测定这一系列溶液的吸光度,然后以吸光度对c(M) / cc(R) / c作图,来确定配合物的组成,如图(8—16)所示。

图8—16连续变化法

六、应用实例

1.磷的测定

微量磷的测定一般采用磷钼蓝或钼锑钪光度法。磷钼蓝是将磷酸与钼酸铵在酸性条件下生成黄色磷钼杂多酸,然后用还原剂将黄色的磷钼杂多酸还原成磷钼杂多蓝,进行测定。常用的还原剂有氯化亚锡、硫酸联氨、抗坏血酸等。用硫酸联氨和抗坏血酸作还原剂时,反应速度慢,且需沸水浴加热,操作较麻烦;用氯化亚锡作还原剂,灵敏度高,显色快,但蓝色的稳定性稍差,对酸度和钼酸铵浓度的控制要求严格;若用抗坏血酸加酒石酸锑钾作还原剂,也可以使磷钼杂多酸转化成稳定的蓝色溶液,此法称为钼锑钪法。

2.微量铁的测定

微量铁的测定目前有邻二氮菲法、硫代甘醇酸法、磺基水杨酸法、硫氰酸盐法等,其中以邻二氮菲法使用最为广泛。

邻二氮菲与Fe2+显色反应的适宜pH范围很宽,在pH 2~9的溶液中均能生成稳定的橙红色螯合物,酸度过高时反应进行较慢;酸度过低时Fe2+将水解,通常在pH约为5的HAc-NaAc缓冲介质中测定。生成的配合物非常稳定,lgK=21.3(20℃),其溶液在508 nm处有最大吸收,摩尔吸光系数为1.11′104 L·mol—1·cm—1。利用上述反应可以测定微量铁,选择性很高,相当于含铁量5倍的Co2+、Cu2+,20倍量的Cr3+、Mn2+、V(Ⅴ),甚至40倍量的Al3+、Ca2+、Mg2+、Sn2+、Zn2+都不干扰测定。



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